Technika: Kvalita mikroskopů a pozorovací techniky.

[Bob]

Zdarec ... včera jsem dlouze dumal o tom jak porovnat mikroskopy mezi sebou (každý prodejce řekne, přijď se kouknout ), a taky jak se liší jednotlivé pozorovací techniky ... překvapivě jsem nenarazil na obrázky, která by to na stejném preparátu porovnávali. Tak mne napadlo ... Mat60 kdysi nabízel, že by tu a tam něco někomu klidně namikroskopoval ... tož Mate ... co takhle vzít něco, co může mít každý kdykoli a kdekoli (aby mohl alůespoň trochu porovnávat) ... navrhuji plíseň z Hermelínu (udej značku a model ) ... myslím, že to pak můžeš i vložit do atlasu. No a ukaž nám, jak vypadají obrázky z pořádného stroje (popiš alespoň některé jeho parametry). Zajímal by mne především normální obraz, obraz v temném poli, fázový kontrast, DIC, a třeba i Nomarského a podobně. Člověk by si pak snad alespoň udělal trochu představu o tom co by měl vidět, kdyby to bylo super duper. Toto samosebou platí i pro ostatní, kdo chtějí s tímto srovnáním pomoci. Bude zajímavé mít vedle sebe obrázky ze stroje za 5 tisíc a 500 tisíc. Asi bude též potřeba uvádět, jak a čím byl obrázek vyfocen. Preparáty nebarvit i barvit, ale porovnat. Jde mi vlastně o to, abych šel do krámu, koupil hermelín a pak vyrazil k prodejci, máznul kus na sklo, zákápl vodou, přihodil druhé sklo a kouknul, vyfotil a porovnal. Myslím, že nějčastěji jsem viděl obrázky mikroznaků ve zvetšení 400x a 1000x ... tož to by asi mohl být nějaký "standard".

[mat60]

No to je fakt zajímavý nápad. Klidně něco nafotím, ať vidíme jaké jsou rozdíly v optice . Ale napadá mě jedna věc a to, že hermelínová plíseň to budou samá vlákna a žádné výtrusy. Bude strašně moc záležet na tom jak připravit preparát, aby vypadal pěkně. Asi bude lepší začít s něčím geomericky líp definovatelným . Teď mě napadají jenom kvasinky, tj. pekařské kvasnice . Jenom nevím jak je šetrně ubezdušit, aby se v preparátu zbytečně moc nepohybovaly a nevyráběly CO2.

Ještě je třeba říct, že kvasinky budou test velmi, velmi obtížný - jsou bílé a skoro průhledné a to je pro většinu mikr. to nejhorší, co je může potkat.

[Bob]

Hele teď mi blesklo hlavou, že nejsme v době kamenné ... vždyť hlívy jsou skoro v každém supermarketu i zelenině !!! OK, v malém městě nikoli, ale tam zase obvykle nejsou ani ti prodejci mikroskopů ... což tedy třeba hlíva !!!!!!!!

[mat60]

[Bob]

Hnojník není tak snadno dostupný jako hlíva v krámě.

[mat60]

Když si Bobe přeješ obrázky výtrusů hlívy ústřičné, tak je máš mít . Je to sice docela problematické focení a obrázky nejsou a nebudou nikdy úplně super, ale jako test mikroskopů (a současně taky digitálů pro snímání) je to docela použitelné, ale extrémně náročné.

Výtrusy jsem získal z přestárlých plodnic, rostoucích u sousedky na špalcích z vlašského ořechu. Výtrusy byly získány přirozeným napadáním na podložní skla a preparáty jsou evidentně kontaminované nějakými bakteriemi.

Výtrusy hlívy ústřičné jsou zcela bezbarvé, průhledné, oválné s velmi nevýraznou a tenkou buněčnou stěnou a obsahují uvnitř spoustu organel s vysokým indexem lomu. Obraz jak v mikroskopu, tak i na fotkách je velmi nekontrastní a je problém na co vlastně ostřit. Cílem není zvýraznit organely, ale hlavně dokumentovat celkový tvar výtrusů a jejich rozměry. Výtrusy hlívy bude proto rozhodně výhodné nějakým způsobem barvit.

Normálně se ostří buď na vnější povrch buněčné stěny nebo tak do 1/3 až 1/2 tloušťky výtrusů. U výtrusů hlívy je největšího kontrastu dosahováno až v zadní polovině tloušťky, kde organely z důvody vysokého indexu lomu tmavnou.

Napřed uvádím různě ostřené obrázky výtrusů při maximálním zvětšení na optickém mikroskopu bez barvení (objektiv PlanApochromat 100x, olej. im.). Obrázky nebyly nijak upravovány, pouze byla zmenšena velikost na 800x600, bez doostřování.

[mat60]

Teď přidávám obrázek s použitím Nomarského diferenční interferenční kontrastu (DIC). Bylo použito max. zvětšení s obj. PlanApochtomat 100x., olej. im. a Nomarského hranol na max. fázový kontrast. Preparáty při Nomarského DIC jsou zbarveny z důvodu interference a fázového posunu polarizovaného světla. Zbarvení závisí na pozici Nomarského hranolu. Cílem DIC je zvýraznit objekty s různým indexem světla, především povrchy buněk ve styku s mediem. Současně s tím objekty dostávají reliéf a vykazují takový pseudoplastický dojem.

[Bob]

No super! ... víš, Mate, co jěště nějaký ostří lupenu či tak něco, co lze udělat okamžitě na místě ... zvětšení třeba jen 40x objektivem.

[mat60]

[mat60]

Ještě jeden obr. z konfokálu a jeho prostorová rekonstrukce.

[Bob]

Časem bude hlíva nepromikroskopovanější houbou DAMyka ... Jinak, myslel jsem vzít houbu k mikroskopu a nikoli mikroskop k houbě ... Myslel jsem, připravit preparát u prodejce a kouknout a nafotit, vystavit tady a porovnat a rozhodnout Těžko tam asi čekat na vypadání výtrusů ... já vím, nechají se doma napadat den předem ... ale ...

[mat60]

[mat60]

Toto je první pokus o barvení výtrusů hlívy. Obr. byly obarveny metylénovou modří (0.25% roztok). Barvení funguje poměrně dobře - výtrusy jsou oproti pozadí trochu obarvené, organely se ale barví daleko intenzivněji. Nejlepší obr. se dosáhně, pokud nastaví WB u kamery na okolí bez výtrusů. Nevýhodou bylo, že výtrusy zřejmě získaly při adsorbci barviva povrchový náboj, neboť vykazovaly Brownův pohyb. Objektiv byl PlanApochromatl 100x, olej. im..

[mat60]

K barvení byl použit nepufrovaný roztok fuchsinu (0.2 %). Barvení fungovalo velmi dobře, lépe než u metylénové modři - výtrusy jsou sytě probarvené, pozadí je skoro bezbarvé. Nebylo potřeba kompenzovat barvu pozadí. Objektiv byl PlanApochromatl 100x, olej. im..

[Bob]

Tak jsem se byl kouknout do jednoho Olympuse. Hlívu měli včera v makru poslední a značně ohmatanou. Pak ji prohmatalo asi 50 lidí na přednášce, a teprve pak putovala do lednice a ráno do Prahy a odpoledne pod mikroskop.

Snažil jsem se udělat preparát z ostří lupenu, ale dost se nám nedařilo. Až na třetí pokus jsme viděli něco, co mi připomíná bazidie. Překvapivě pro mne pouze s jedním "nosníkem" pro výtrus. Po výtrusech ani vidu ani vidu. Opravte mne jestli se mýlím. Kousek byl odříznut kapesním nožíkem, šoupnut do kapky vody z vodovodu a přikryt sklíčkem, které bylo lehce přitlačeno.

Na obrázku je produkt následující optické soustavy:

Mikroskop CX41 + PLNC (= planachromat C) 40x Ph.C. + Trinokular FN=20 50% oko 50% foťák + nástavec s čočkou 2,5x + kompakt CP 350 (CCC 1/1,8", 8 MPix (ale asi nefotil na celý čip neboť pořízený obrázek je menší)). Foceno do JPG (nastavení nevím a navíc je to obtížně porovnatelné). Obrázky jsou výřezy 1:1 uložené v JPG 100% kvality. Vlevo je bright field (tedy normálně) a vpravo je stejný objektiv ale s Ph.C. (= phase contrast = fázový kontrast) a také samosebou bright field. Celý obrázek zachycoval plochu asi 269 x 202 mikrometrů.

Jak je vidět, těch optických členů je asi přeci jenom moc a aberace je značná.

Zítra přinesu totéž, ale za zrcadlovky, tj. vyřadí se nástavec 2,5x a objektiv - na displeji to foťáku to vypadalo výrazně lépe.